Es una especie tímida, solitaria y sigilosa, de hábitos nocturnos o crepusculares, aunque es posible sorprenderlo a plena luz del día.
Posee una gran agilidad para moverse en el estrato arbóreo, sobre todo sobre ramas altas, donde descansa o se dedica a la captura de aves o monos. También utiliza los huecos en los árboles para refugiarse. De todas formas no desprecia el suelo, donde realiza gran parte de sus cacerías.
Entre sus presas se cuentan cuises, nutrias, cachorros de corzuelas y pecaríes. Puede cazar también pequeños coatíes, lagartos overos, tapetíes, agutíes, comadrejas y carpinchos.
Parece tener dos técnicas de caza: perseguir a su presa muy lenta y sigilosamente de modo activo, o simplemente sentarse a esperar entre 30 a 60 minutos para luego desplazarse a otra área y recomenzar el acecho.
Su época de cría abarca desde octubre a enero, y da a luz entre 1 y 4 cachorros. El período de gestación aproximado es de 70 a 85 días. Como todos los gatos necesita de grandes territorios: estudios indican que una población de 500 ocelotes tendría un requerimiento de territorio de poco más de 600.000 hectáreas. En el Parque Nacional Iguazú se estima una densidad de entre 5 y 17 individuos por cada 100 km². Su longevidad máxima en cautiverio fue de 20 años.